材料與試劑

熒光定量 PCR 儀( MyGo Pro) ，IT-IS Life Science Ltd; 實(shí)時熒光定量 PCR 儀( Qtower 2． 2) ，德國耶拿公 司; 電熱恒溫水槽( DK-8D) ，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限 公司; 高速冷凍離心機(jī)( 5424R) ，Eppendorf 有限公司; 超微量分光光度計(jì)( Q6000) ，美國 Quawell。新鮮牛乳樣品采集于陜西省西安市未央?yún)^(qū)某奶 牛場，新鮮羊乳樣品采集于未央?yún)^(qū)某市場農(nóng)戶處，樣 品存于 － 20 ℃ 冰箱備用; 其他用于驗(yàn)證引物特異性 DNA( 雞、豬、馬、兔、鴨、狗和貓) 樣本購買于四川華 漢三創(chuàng)有限公司; 其他不同類型全脂羊奶產(chǎn)品、低脂 羊奶產(chǎn)品、羊奶片等實(shí)際樣品隨機(jī)購買于大型商場。

實(shí)驗(yàn)方法

LAMP 擴(kuò)增所用的酶最適反應(yīng)溫 度為 60 ～ 68 ℃，當(dāng)反應(yīng)溫度降到 60 ℃ 以下時，聚合 酶的酶活力減弱，擴(kuò)增效率降低，因此選擇 60、61、 62、63、64 和 65 ℃ 6 個溫度對反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。 改變奶牛和奶山羊的引物用量體積比例，即 0． 1 ∶ 0． 2、0． 15∶ 0． 2、0． 2∶ 0． 2、0． 1∶ 0． 3、0． 1∶ 0． 4，以挑選出 最適引物濃度比。取 7 ng /μL 的羊乳 DNA 為原液，分別摻入不同 體積比例的牛乳 DNA，體積比例依次為 100% 、80% 、 50% 、10% 、5% 、1% 、0． 1% 和 0% ，取 1． 2 μL 上述混 合 DNA 作為模板進(jìn)行 LAMP 擴(kuò)增，分析此方式的檢測 限。在羊乳實(shí)際樣品中混合不同體積比例的牛乳，混 合體積比例為 100%、50%、15%、5%、1%、0． 5% 和 0%，再進(jìn)行 DNA 提取，確定此種混合方式的檢測限。為了驗(yàn)證方法的可行性，本實(shí)驗(yàn)對奶牛、山羊及 兩者混合 DNA 進(jìn)行 LAMP 檢測。盡管 LAMP 的擴(kuò)增 產(chǎn)物是一系列大小不一的 DNA 片段混合物，但 Tm 值 相對穩(wěn)定，這主要取決于靶序列長度和目標(biāo)片段 GC 比例。

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